Una de las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido esencial en el diagnóstico e identificación de pacientes infectados por SARS-CoV-2. Esta técnica ha generado no poca polémica y comentarios, más motivados por la ignorancia de la Biología Molecular que por motivos reales. En ésta entrada vamos a intentar explicar en qué consiste ésta compleja técnica y os mostraré un ejemplo de resultado real.

En los años 1980, el bioquímico Kary Mullis (que, por cierto, era un yellow jacket como yo, pues estudió en Georgia Tech) desarrolló una técnica para detectar regiones específicas de un DNA mediante su amplificación utilizando una DNA polimerasa. La técnica no era muy eficiente, pero Mullis supo aprovechar otro descubrimiento previo: las bacterias termófilas, que viven a altas temperaturas en aguas hidrotermales. En uno de estos organismos, la bacteria Thermus aquaticus, descubierta en las aguas hirvientes del parque de Yellowstone, se identificó una proteína clave: la Taq DNA polimerasa. Esta enzima puede polimerizar el DNA a temperatura más alta de lo normal y es estable térmicamente. Esto permitió a Mullis optimizar su técnica de PCR (siglas de reacción en cadena de la polimerasa) y obtener una cantidad medible de una secuencia de DNA a partir de una muestra en la que solo hay unas pocas moléculas.

Estructura molecular de la Taq polimerasa, con una molécula de DNA. La proteína tiene varios dominios y permite obtener una copia de una secuencia de DNA. En la técnica de la RT-qPCR el dominio exonucleasa puede ser esencial, como veremos. Figura hecha por elaboración propia usando el software Chimera/UCSF

Las aplicaciones de la PCR no dejaron de incrementarse en los años siguientes, teniendo innumerables aplicaciones en diagnóstico, investigación biomédica, ciencia forense, investigación medioambiental y geoastrobiológica, por mencionar algunas. En un ejemplo de aplicación, si una muestra ambiental o biológica, por ejemplo, contiene un organismo determinado, secuencias específicas de su DNA pueden amplificarse, generando innumerables copias, de modo que pueda detectarse y medirse.

Termocicladores, la instrumentación usual en la reacción PCR. El termociclador es, simplemente, un pequeño horno programable muy eficiente. Esta instrumentación no es la que se usa en el diagnóstico del SARS-CoV-2.

Con el tiempo, se han ido desarrollando variaciones de la técnica de la PCR, que han mejorado y aumentando su aplicabilidad en diferentes campos. Una de estas técnicas, que ha resultado ser esencial durante la pandemia de COVID-19, es la RT-qPCR o “Reverse Transcriptase-quantitative PCR”. Esta técnica extiende la capacidad de análisis de la PCR tradicional a la detección de RNA, utilizando una enzima que genera, a partir de una molécula de RNA, una secuencia complementaria de DNA (aquí el lector debe tener clara la diferencia entre RNA y DNA, así como el concepto de transcripción). Esta enzima se denomina transcriptasa reversa o inversa.

La RT-qPCR permite identificar pequeñas cantidades de un RNA específico en una muestra, mediante la síntesis de una hebra de DNA complementario y la amplificación de ésta. Ello abre la puerta al diagnóstico de infecciones por virus de RNA, como es el caso del SARS-CoV-2 (recomiendo ver la noticia Nº59 en este blog, sobre la biología del coronavirus). Otra ventaja de ésta técnica es que permite cuantificar cuánto RNA de partida tiene la muestra e identificar a pacientes con virus replicándose activamente. Vamos a describir brevemente la técnica, tratando de no entrar en muchos detalles. La RT-qPCR es una técnica complicada y no es nada sencillo explicarla al público general; aun así voy a intentarlo, tras ver cómo se han dicho muchas incorrecciones y falsedades, incluso por parte de médicos que, obviamente, no tienen conocimiento práctico de la técnica.

Para identificar la presencia del genoma viral, primero debemos obtener la muestra. Esto se realiza introduciendo un hisopo de algodón en la zona nasofaríngea del individuo. Este algodón impregnado se lleva al laboratorio, donde se lleva a cabo el primer paso del test: la separación y purificación del RNA contenido en la muestra. Si el individuo tiene virus, independientemente de si están vivos o no, y ha preservado RNA viral, aunque esté en pequeña cantidad, podrá ser extraído y amplificado. Una ventaja para nosotros es que el RNA es una molécula inestable, por lo que un RNA viral “muerto” no puede permanecer mucho tiempo en el paciente, reduciéndose la posibilidad de un falso positivo por ésta vía.

Diagnóstico del virus. El proceso tiene varias fases y, en total, requiere un tiempo de 2 a 4 horas para hacer el test. El punto clave en la especificidad del test es la selección de los primers o cebadores. En el caso del diagnóstico de SARS-CoV-2, unos primers usuales son secuencias del gen de la proteína E (glicoproteína pequeña de la envoltura). Para la detección, se utilizan dos primers para el gen E, el primer “forward” y el primer “reverse”, para completar cadenas complementarias, así como una sonda, que se une al gen a identificar. Si en la muestra hay RNA viral, la DNA polimerasa realizará la síntesis y romperá la sonda, liberando una molécula fluorescente y permitiendo la detección.

Una vez que hemos generado un cDNA, o DNA complementario a la secuencia del RNA viral, vamos a la fase de amplificación. El DNA se hibrida con los cebadores o primers específicos del gen o secuencia que queremos identificar. El uso de los primers se basa en que la polimerasa requiere el primer para realizar la síntesis de la nueva hebra de DNA. Es decir, donde no haya primer o cebador, no hay síntesis y, por tanto, no hay amplificación. Así que tomamos los primers específicos para el DNA que queremos amplificar y éstos se unirán a la secuencia que queremos. En el diagnóstico del SARS-CoV-2 se han usado primers para varios genes; uno de los más habituales, dada la sensibilidad y especificidad resultante, es el gen que codifica la proteína E o glicoproteína pequeña de la envoltura. Es decir, añadimos los primers a la muestra que estamos estudiando y, si hay genoma viral, se unirán a las secuencias específicas complementarias. Allí donde los primers estén unidos (o hibridados, en la terminología técnica), la DNA polimerasa podrá hacer su trabajo y generar una copia complementaria de la secuencia. Este proceso de unión de los primers-síntesis de la nueva secuencia de DNA-separación del DNA de doble hebra generado-nueva unión de primers es un ciclo de amplificación.

Molecular mechanism of DNA replication (article) | Khan Academy
Esquema de la síntesis con polimerasa. La enzima se une al punto donde el primer está unido a la secuencia que queremos copiar, y comienza a sintetizar la nueva hebra. La reacción funciona hasta que ha completado la hebra. Figura tomada de aqui

En resumen: si tenemos algunos virus en la muestra del individuo, al cabo de varios ciclos de amplificación habremos generado un número enorme de moléculas de DNA. Al ser una reacción en cadena, cuanto más RNA de partida tengamos, más moléculas de DNA vamos a generar, y, por tanto, menos ciclos necesitaremos para tener una cantidad enorme de DNA. ¿y cómo vamos detectando que se está produciendo la amplificación y se está generando DNA? Hay varios métodos de detección. Uno de los habituales implica el uso de una sonda. Esta sonda es una molécula de DNA con una secuencia complementaria a la que queremos identificar. Si la secuencia que queremos identificar está presente en la muestra, la sonda se unirá a ella, además de los primers. La sonda contiene, unidas a ella, dos moléculas: una molécula fluorescente y otra molécula que bloquea la fluorescencia (la llamamos quencher). Cuando actúa la DNA polimerasa, ésta va sintetizando la nueva secuencia, hasta que se encuentra con la sonda entorpeciendo su camino. Entonces actúa la actividad exonucleasa, quitando de enmedio la sonda, rompiéndola. Al romperla, la molécula fluorescente se libera.

Actividad polimerasa y exonucleasa. La 5′-exonucleasa retira la sonda del camino, completando la polimerasa la secuencia.

La molécula fluorescente libre, entonces, podrá ser detectada si iluminamos la muestra con luz ultravioleta. Cuantas más moléculas fluorescentes se liberen, más DNA se estará sintetizando. Este proceso se observa en tiempo real: si el paciente contiene el genoma viral, la concentración de moléculas fluorescentes libres irá aumentando con cada ciclo de reacción, aumentando la fluorescencia gradualmente, siguiendo una curva sigmoidal. Si el paciente no contiene el genoma viral, no se liberarán moléculas fluorescentes y la fluorescencia de la muestra se mantendrá por debajo de un umbral de fondo. Controlando la reacción en tiempo real, es fácil identificar un paciente con genoma viral y, además, podemos estimar su “carga viral” y si la infección está activa o está disminuyendo. Espero que el lector no se haya perdido demasiado hasta ahora, ya advertí que la técnica tiene cierta complejidad. Vamos a ver un ejemplo real.

Un equipo para la realización del test RT-qPCR. Como se ve es bastante distinto de los termocicladores clásicos. En el cajón abierto se inserta la placa de pocillos que contienen las muestras de los pacientes.
Aspecto de una placa con muestras lista para analizar. Cada pocillo corresponde con un paciente, mas los controles (controles positivos y negativos).

En esta prueba se realizó el test a 20 pacientes cuyas muestras nos enviaron para un estudio, y obtuvimos un positivo. La prueba tarda unas dos o tres horas en llevarse a cabo y en la siguiente figura muestro el resultado. Tras el proceso que he descrito, se obtiene la curva de amplificación para cada muestra:

Aspecto del resultado de un test por RT-qPCR

En la gráfica del resultado es muy fácil identificar los pacientes positivos: una intensa curva sigmoidal en la fluorescencia, apareciendo ésta a un número menor de ciclos cuanto mayor es la carga viral. El ciclo al que la fluorescencia de la muestra del paciente supera el umbral se denomina Ct. Cuanto menor es el Ct, es decir, cuantos menos ciclos necesite para superar el umbral de fluorescencia, mayor es la concentración de RNA de partida. Utilizando un calibrado, se puede conocer cuanto RNA contenía la muestra inicialmente.

En el gráfico mostrado se puede observar un grupo de muestras con resultado negativo: su fluorescencia se mantiene baja y constante pudiéndose, como mucho, aumentar de forma no exponencial hacia el final del experimento. Si tras 40 ciclos no ha habido incremento de fluorescencia o éste no ha superado el umbral, ni muestra el patrón característico en su curva, consideramos que la muestra no contiene el RNA viral. Ahora observemos la muestra positiva: a partir del ciclo 20, su fluorescencia comienza a entrar en una curva sigmoidal, superando el umbral hacia el ciclo 23. La forma de la curva es claramente un caso positivo: tenía RNA viral en abundancia. Para confirmar el caso, realizamos un nuevo test tras 24 horas. Los individuos que estuvieron en contacto con la persona infectada durante algunos días volvieron a dar negativo (llevar la mascarilla puesta resultó esencial para frenar los contagios), pero la muestra de la persona infectada cambia: tras 24 horas su Ct se ha reducido a 15-16. Esto quiere decir que en el transcurso del día, el virus se ha estado replicando activamente e incrementando la carga viral del paciente. Sin duda la persona no sólo es positivo para el virus, sino que en ése momento su infección estaba en pleno crecimiento.

Para controlar que todo funcione bien, se utiliza un control positivo (un RNA puro con la secuencia que queremos identificar), que da una curva con una fluorescencia intensa. También se utiliza un control negativo sin muestras, así como controles sin una de las enzimas, para identificar contaminaciones y el fondo producido por las sondas. En caso de que el control negativo diera excesiva señal, habría que investigar si hay un problema y repetir el análisis. En el caso del experimento mostrado, los controles han funcionado bien y la muestra positiva no ofrece dudas. Aun así, se puede realizar un ensayo confirmatorio utilizando primers para otro gen del virus (normalmente el gen de la RNA polimerasa viral).

Ahora vamos a comentar una desventaja de ésta técnica, que está en relación con su sensibilidad limitada. Cuando la muestra de un individuo ofrece un resultado negativo, hay que considerar varios aspectos: el riesgo de haber contraído el virus, que es difícil de estimar, así como la presencia de síntomas ligeros (tos o febrícula). Por ejemplo, si un individuo muestra síntomas ligeros y tiene una probabilidad estimada del 90% de haber contraído el virus, un negativo en la PCR aún indica que tiene una probabilidad del 74% de tener el virus. Un segundo test realizado tras 24 horas, si es negativo también, reduce drásticamente la probabilidad de que el individuo tenga el virus activo. Es decir, un solo test con resultado negativo es insuficiente para considerar al individuo libre de virus, si por sus síntomas o exposición es probable que haya sido infectado. Esto debéis tenerlo en cuenta si os realizan un test PCR y sabéis que habéis estado expuestos al virus o tenéis síntomas leves. En la práctica, si tenéis síntomas leves y sabéis que habéis estado expuestos al virus, debéis autoconfinaros aunque el resultado del test PCR sea negativo; ante una probabilidad elevada de estar contagiados, es necesario al menos un segundo test PCR y seguir el protocolo de confinamiento.

Gracias por leerme y llegar hasta aquí. La PCR no es una técnica sencilla, por lo que si detectas algún error o aspecto importante que creas que hay que mencionar, por favor, no dejes de comunicármelo.

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