La luciérnaga y la magia de los peróxidos.

A mi los insectos me producen una sensación contradictoria. Por un lado, se me erizan los pelillos solo con ver uno de ellos, cualquiera. Por otro lado, ejercen sobre mí una fascinación que no he encontrado en ningún otro animal, organismos (los animales) que, en general me interesan mucho menos que las plantas o los microorganismos, que tienen una bioquímica mucho mas interesante. De entre los insectos, algunos de los que más me fascinan son los que conocemos genéricamente como “luciérnagas”.

Anoche vi una. Ahora es raro encontrar una luciérnaga en zonas próximas a las ciudades, ya que, como casi todos los insectos que no son dañinos para nosotros, es muy sensible a la contaminación, a la luz artificial (por razones obvias), al cambio climático y, en fin, a casi todo. Pero cuando era pequeño, en noches de julio como ésta, solía verlas con frecuencia; a veces encontraba hasta una docena de ellas, en nuestro siempre asalvajado jardín. Eran otros tiempos, de noches frescas y de olor a madreselva, ranas croando, entregadas al amor desenfrenado, a lo lejos, en el arroyo de aguas cristalinas. En aquel tiempo, en el jardín salvaje, la vida de los animalillos mas pequeños era tan bulliciosa que por la noche, si escuchabas, podías oirles andar, corretear, interaccionar y representar el drama de la vida una y otra vez entre las plantas. Todo tenía sus desventajas, claro…de pequeño me asustaban las mantis, a veces enormes, que te miraban de modo inquietante. O las temibles escolopendras…y en casa tenía que tener cuidado con las reclusas pardas o con las avispas, que solían hacer nidos en cualquier recoveco y cada vez son mas raras.
Pero no había mas mosquitos que ahora…y si que había menos cucarachas. Algo ha cambiado para mal en el mundo de los bichos. Ya casi no veo mantis, ni las preciosas libélulas, ni mariquitas, ni, por supuesto, luciérnagas. No se si es porque todo está mas “urbanizado” y “civilizado” o por qué.

En fin, dejando de divagar, anoche vi una luciérnaga, por lo que el “casi” que he usado antes sigue vigente, por fortuna. Se trataba de una hembra de Lampyris noctiluca, que intenté fotografiar en acción:

Aqui veis los segmentos ventrales iluminados:

Y este es el aspecto de este curioso escarabajo:

Como todos los escarabajos (orden Coleoptera) es de buen tamaño y sus patitas tienen una fuerza sorprendente. Este ejemplar tiene la longitud de una moneda de 20 céntimos. La hembra tiene un aspecto larval, con unos élitros pocos desarrollados y carente de alas. El macho tiene el aspecto típico de un coleóptero, es alado y puede volar, capacidad que usa para acercarse a la llamada luminosa de la hembra, que pueden ver desde mas de 50 metros de distancia. Tras hacer la foto la dejé en el sitio en el que estaba y rápidamente volvió a encender su “lamparita”.

Una maravilla bioquímica

El mecanismo bioquímico responsable de la bioluminiscencia, o emisión de luz por parte de éste insecto y otros organismos se basa en la descomposición de un peróxido (molécula que contiene dos átomos de oxígeno unidos asi “-O-O-“). Es una reacción fascinante y encierra un interesante misterio:
Los elementos clave del mecanismo de emisión de luz los descubrieron los investigadores del grupo de William McElroy, en USA, durante los años 60 y mas tarde, en los años 70, el laboratorio de Gary Schuster en Georgia Tech identificó los mecanismos electrónicos de la molécula responsable de la emisión de luz. Los órganos luminosos de la luciérnaga contienen los dos materiales protagonistas: la luciferina, un derivado del benzotiazol, que purificó y cristalizó a partir de éstos bichitos, y la luciferasa, el enzima que cataliza la reaccion “luminosa”.
Posteriormente, se fué conociendo el mecanismo que, en resumen, es éste:

 

El enzima luciferasa tiene actividades ligasa y oxigenasa. Convierte la luciferina, primero en su derivado adenilado y luego en un peróxido.
Todos los peróxidos orgánicos son muy inestables y éste, espontáneamente, se rompe, generando una molécula de oxiluciferina cuyo oxígeno se encuentra en un estado excitado electrónicamente llamado “singlete”. La formación de una molécula con un oxígeno en estado excitado tras la ruptura de un peróxido es común y es la base de las bioluminiscencias. En este caso, las moléculas excitadas decaen a su estado fundamental con una vida media de 10-9 segundos, emitiendo el exceso de energía en forma de luz de color verde amarillento, con una longitud de onda de, en el caso de Lampyris noctiluca, exactamente 550 nm. Una curiosidad: la emisión luminosa de nuestro animalito constituye la fuente de luz mas eficiente del mundo con una eficiencia cuántica del 100% (esto es, el número de moléculas que reaccionan dividido entre el número de fotones emitidos es 1). Para que os hagais una idea, nuestras fuentes de luz mas eficientes, los LED tienen una eficiencia cuántica entre el 50 y 60% en los mejores casos.

Un aspecto interesante es el mecanismo que utiliza el organismo para reciclar la luciferina “gastada”: gracias al enzima LRE (luciferin regenerating enzyme), la oxiluciferina se rompe, generando un intermediario cianurado que reacciona con cisteína, regenerando la luciferina. Este paso del metabolismo de la luciferina no fué descubierto hasta el año 2001, en el que se publicó la descripción del enzima LRE. La Bioquímica es fabulosa reciclando moléculas para ahorrar energía

Pero aun no están claras muchas preguntas en torno a la bioluminiscencia de estos bichitos. Por ejemplo, se piensa que el control de la longitud de onda (color) de la emisión luminosa se realiza mediante tautomería de la oxiluciferina: si el bicho quiere emitir luz mas rojiza, usa la forma ceto, si quiere mas verdosa, usa la forma enol. Tampoco está demasiado claro el mecanismo de encendido-apagado que usan.
Las implicaciones de esta maravillosa reacción son muchas. Por ejemplo, la luciferasa se ha convertido en una herramienta importantísima en Bioquímica y Biología Molecular y sus aplicaciones van desde la Medicina hasta la industria biotecnológica y las ciencias ambientales. Así, se usa en el estudio de la progresión de enfermedades infecciosas, de la progresión de tumores, como biosensor en el estudio de contaminantes ambientales…. Supongo que esto bastaría para responder al típico ignorante, que preguntaría al descubridor de la luciferasa eso de “¿y para que sirve?”.
Volviendo a nuestra luciferasa, un gran misterio es el origen evolutivo de este fenómeno. La bioluminiscencia es relativamente común en la bioquímica terrestre y los insectos son la clase biológica donde mas casos se dan, pero también se da en bacterias, protozoos y hongos, siguiendo mecanismos similares.
No esta claro donde pudo estar el origen, pero parece que la luciferasa de los insectos proviene de una acil-CoA ligasa implicada en la activación de los ácidos grasos. Parece, además, que la bioluminiscencia tiene un papel fundamental en la regulación del estres oxidativo celular y es posible que provenga evolutivamente a partir de los sistemas naturales de regulación de la capacidad oxidante del oxígeno y el peróxido de hidrógeno. Pero…¿como llegó a convertirse en un medio de comunicación elaborado?

Una muestra de luciferina pura se “activa” en presencia del enzima luciferasa y ATP en un simple tubo eppendorf. Esta maravillosa reacción tiene mas aplicaciones de las que os podais imaginar. Imagen tomada de Conley et al. Angewandte Chemie, 51, 3350 (2012). Comparad el color de la luz con el de la luciérnaga.

Otro gran misterio es el mecanismo de activación y apagado de la luz, que los insectos controlan con gran eficacia. Parece que la síntesis de monóxido de nitrógeno (NO) es el factor desencadenante, al aumentar la disponibilidad de oxígeno para la bioluminiscencia. Yo no lo se, pero cuando el animalito activa su luz, contrae rítmicamente el abdomen y la luz comienza a encenderse, alcanzando su máximo al cabo de uno o dos minutos.

El misterio en torno a la luminiscencia ha hecho pensar a muchos investigadores. Hay incluso quien sugiere que, dada la convergencia evolutiva y la conservación de la bioluminiscencia en la bioquímica terrestre, el hecho de que sea común en todas las formas de vida simples, así como su papel en la regulación del estres oxidativo, es posible que la bioluminiscencia sea un fenómeno “universal” en la vida y la luciferina debería ser un sensor eficaz en la detección de vida extraterrestre simple.

Imitando a los insectos bioluminiscentes: el luminol

Todos los bioquímicos conoceis bien la reacción del luminol. Es un buen ejemplo de quimioluminiscencia que imita a la bioluminiscencia de la luciérnaga. Y es una reacción muy sencilla de realizar y muy instructiva. La quimioluminiscencia del luminol fue descubierta por el químico aleman Albrecht en 1928, y otro químico alemán, Walter Specht, comenzó a usarlo en la investigación criminal en 1937. Sin embargo, su mecanismo no se ha conocido hasta finales del siglo XX. Es interesante, ya que el mecanismo tiene bastante en común con la reacción de la luciferasa, aunque el desarrollo del luminol fué independiente y no inspirado en la bioluminiscencia.
Como pasaba antes, la oxidación del sustrato (luminol) por el oxígeno naciente generado en la descomposición del agua oxigenada produce un intermedio peróxido, que se descompone rápidamente formando una molécula con el oxígeno en estado excitado. Al volver a su estado fundamental, la molécula emite una bonita luz azul. Aquí los detalles del mecanismo electrónico son ligeramente distintos que en el caso de la luciferina, pero a grosso modo tenemos el mismo tipo de reacción. Como veis, el producto final es 3-aminoftalato, es necesario que la molécula se encuentre desprotonada, por ello la reacción tiene lugar en medio básico y se añade NaOH en la mezcla luminosa.
foto de wikipedia…es que no tengo un equipo fotográfico adecuado para hacer esta foto yo mismo.
La clave de la utilidad de la reacción está en el paso de agua oxigenada a oxígeno. El luminol sólo se “activa” en presencia de catalizadores eficaces que descompongan el agua oxigenada, como por ejemplo las peroxidasas presentes en algunos materiales biológicos, la hemina de la sangre y otros complejos de hierro.
Pero no hace falta mucho esfuerzo para conseguir ésto por vosotros mismos, bastan algunos productos químicos. Os propongo ésta síntesis, de nivel prácticas de química universitaria, que podeis hacer en un laboratorio con un equipo mínimo (y una campana de gases):
La reacción consiste primero en la síntesis de 3-nitroftalil-hidrazida a partir de anhídrido 3-nitroftálico. Usamos este producto de partida, primero porque el nitrógeno en forma de grupo nitro está “protegido” durante la reacción. Además es un producto asequible. Después, tenemos que reducir el grupo nitro a grupo amino, tarea sencilla con el reductor adecuado, en este caso el ditionito, un reductor fuerte y muy barato también.por pasos (es el método que he seguido yo y ha funcionado perfectamente):

1- Mezclad en un en un matraz redondo de 50 ml 1 gramo de anhídrido 3-nitroftálico, 0.7 gramos de sulfato de hidrazina, 1 gramo de acetato sódico y 4 ml de agua.

2- Hervid. Desprende ácido acético, con olor a vinagre característico (campana!). Queda una suspensión no muy bonita y algo pastosa de 3-nitroftalato de hidrazina.

3- Añadid 5 ml de glicerol y calentad para eliminar el agua. Para ello colocad un termómetro de laboratorio de modo que toque el fondo del  matraz y mantenedlo a 200-220º durante 4 minutos. Sin miedo. El contenido se pone de color naranja.

4- Enfriad hasta 100ºC y añadid 40 ml de agua. Precipita la 3-nitroftalilhidrazida, de color amarillo claro. Metedlo en el congelador o un baño de hielo. Queda el precipitado amarillo y el sobrenadante. El sobrenadante, fuera. El producto sólido se lava con agua en el mismo matraz y sin secarlo, se añaden sobre él 5 ml de NaOH al 10%. Si todo va bien, ahora la cosa se pondrá roja. Entonces añadid 3 gramos de ditionito sódico, que reducirá el grupo nitro a grupo amino.

5- Calentad a ebullición 3 o 4 minutos. Debe precipitar el luminol. Enfriad, añadid dos mililitros de ácido acético glacial y precipitará toodo el luminol.

Como veis la síntesis no es complicada, se puede hacer incluso en un tubo de ensayo, los reactivos son baratos y pueden adquirirse en proveedores de productos químicos. Además, en las cantidades que se usan, la reacción no reviste ninguna peligrosidad. Con éstas cantidades de reactivos tendréis luminol hasta el aburrimiento y la ventaja a comprarlo hecho es que aprendéis mas química :).
Ahora, os propongo algun experimento básico:
Disolved mas o menos 0.1 gramo de luminol seco en 10 ml de NaOH 10% y diluid hasta 1 litro. Esta es la solución A.
Disolved 0.5 gramos de ferricianuro potásico en 75-100 ml de agua. Añadid 15 ml de H2O2 3% (agua oxigenada corriente) y diluid a 1 litro. Solución B.
Mezclad porciones iguales de A y B, apagad la luz y disfrutad del espectáculo.
Hay muchísimas variaciones sobre esta reacción. Si no disponeis o no podeis conseguir el ferricianuro, el sulfato de cobre funciona perfectamente:Disolved una cucharadita pequeña de luminol en una botella de 1 litro llena hasta la mitad con agua. Completad la botella con agua oxigenada corriente y añadid unos cristalillos de sulfato de cobre. Cerrar la botella, agitad y vereis la luz.
Si en vez de agua oxigenada añadis una cucharada de detergente “con oxigeno activo”, vereis que funciona también. Se puede usar perborato sódico (se adquiere en farmacias). En definitiva, cualquier fuente de peróxido y cualquier catalizador que lo descomponga (iones de cobre, complejos de hierro, enzimas…) hace funcionar la reacción.
Sin embargo, os preguntaréis (o deberiais), por que ferricianuro en el primer experimento. Ferricianuro es la forma oxidante. Bien, aquí el mecanismo es algo diferente: el paso esencial es la oxidaciòn parcial del luminol por el ferricianuro a un intermedio diferente, que reacciona con el oxígeno producido por descomposición del agua oxigenada.

Jugando a policía científica

Os propongo éste experimento, que he probado y funciona espectaculamente:
  1. Disolved 8 gramos de NaOH en medio litro de agua destilada. Esta es la solución A
  2. Diluid 10 ml de H2O2 del 30% (la que venden en botellas de plástico negras. Cuidado que es corrosiva) en 490 ml de agua destilada. Esta es la solución B
  3. Disolved 0.354 gramos de luminol en 63 ml de la solución A. Diluid a medio litro con agua destilada. Esta es la solución C
Ahora, mezclad 10ml A+10ml B + 10 ml C + 70 ml agua destilada. Esta mezcla la poneis en un frasco de spray.
Y ya está. Podéis rociar con el spray la solución de luminol donde creais que ha habido una mancha de sangre o semen, por ejemplo, con la luz apagada y la habitación completamente a oscuras. Veréis que las zonas donde ha estado manchado se iluminan con un visible destello azul, mas intenso cuanto mas reciente o menos limpia está la zona, pero visible aunque se haya intentado limpiar. Podeis ver el efecto que tiene sobre las sábanas, tapicerías de coche etc… una noche loca con vuestra chica/chico/chicas o lo que os guste.
O rociad con el spray despues de ir al baño…ya sabeis…y veréis vuestros residuos con una perspectiva muy distinta…
¿creeis que sois muy limpios en casa? probad a rociar con esta solución sobre la encimera de la cocina o la pila, en especial si habéis estado limpiando pescado…o el lavabo, en especial si os cortasteis afeitandoos. Aunque no queden restos visibles de sangre, el luminol revela dónde estuvo.
Tambien podeis mezclarlo con orina si sospechais que hay sangre en ella…si hay sangre en la orina, la reacción será intensamente positiva.
La clave de este test está en el hecho de que los fluidos corporales contienen enzimas y complejos de hierro que catalizan la descomposición rápida del agua oxigenada. Cualquier catalizador que descomponga el agua oxigenada dará positivo en la reacción del luminol.
Esto con lo que estamos jugando se llama la formulación de Weber y se usa en investigación forense desde los años 60. Ya veis a donde nos ha llevado nuestro pequeño escarabajillo luminoso.
¿Quieres saber mas? prueba con:Barni, F et al. Talanta, 72, 896-913 (2007)
Viviani, V.R. Cell. Moll. Life Sci. 59, 1833-1850 (2002)
Waldenmaier, H.E. et al. Int. J. Astrobiol. doi 10.1017/S1473550412000146 (2012)

Esta entrada participa en el XXVII Carnaval de Química, alojado en el blog Educación Química, capitaneado por el Dr. Bernardo Herradón, un gran impulsor de la divulgación química.

Y también en el XIV

acogido por nuestra amiga Uuq en Pero eso es otra historia…

15 thoughts on “La luciérnaga y la magia de los peróxidos.

    1. Buena idea, pero sólo si te ha gustado el post…

    2. ¡Guuuuuaaaaaau! Me encantan los insectos, así que el post me ha vuelto loco. No conocía la luciferina, pero, fíjate, lo que más me ha llamado la atención no ha sido la elevada eficiencia del proceso luminoso, no, sino que la oxiluciferina vuelve al ciclo transformándose de nuevo en luciferina. ¡Asombroso!

    3. Muchas gracias!. Si, una de las cosas fascinantes de la Bioquímica es que todo es cíclico y con tendencia al reciclado. Una molécula tan preciosa no puede desecharse!. Es interesante que el mecanismo de recuperación de la oxiluciferina no se descubrió hasta tiempos recientes. En 2001, unos investigadores japoneses, Gomi y Kajiyama, publicaron la descripción del enzima LRE (Luciferin Regenerating Enzyme). Dada tu cuestión, he modificado el esquema, añadiendo este dato, que me parece interesante.

  1. ¿Cómo no me va a gustar? Espectaculares las fotos de tu ‘amiga’ luciérnaga (tanto que se me han erizado los pelillos, uf!…), magistral la exposición de la bioluminiscencia recurriendo a los mecanismos químicos (que los biólogos me perdonen, pero después de un año estudiando los estados singlete y triplete , ¡ya podían conocer ellos la base fisicoquímica de la luz de las luciérnagas!), la historia que no conocía de cómo se descubrió la luciferasa,… ¡Y encima recetas para experimentar con luminol! No conocía a Manuel Riesgo, pero presiento que me voy a dejar el sueldo en este tipo de productos… Primero seguiré las pautas que he ido leyendo en tu blog y luego…, pero ya estoy yendo demasiado lejos… En cualquier caso, es una afición que merece la pena desarrollar, ¡mooola! Por cierto, ¿conoces el libro del Tío Tungsteno? Tenéis puntos en común jajaja. Por aquí andamos comentándolo capítulo a capítulo

    1. Vaya, pues muchas gracias! me encanta que te haya resultado tan interesante!. Y me encanta que me hayas comparado con Oliver Sacks. Precisamente tengo al Tio Tungsteno en la mesilla de mi cama y me agradó conocerlo y comprobar que la famosa escena de la tabla periodica en “awakenings” tiene mucho fondo…
      Creo que, aunque sea un químico de profesión, siempre seré un químico amateur. Esto me ha hecho recordar que mi afición por la química y mi nexo quimica-mineralogía viene impulsado por dos libros de mi niñez-pubertad, “geoquímica recreativa”, de Alexander Fersman y “Los Gases Nobles” del sin par Asimov. Creo que me los habré leido mil veces.

    2. Extraordinario el grupo de debate en torno al Tio Tungsteno. Abrumador casi… muchas gracias por el enlace!.

    3. Sería un placer contar contigo 🙂 seguro que tienes mucho que aportar!

    4. uyy, yo no. Me abruma la cosa cuando hay tantos comments y discusión. Soy mas de diálogo entre dos, leer y callar.

  2. Wooooow muchas graciasno tenia la menor idea de todo lo que estaba detras de una luciernaga y su “linternita” hahaha Buen dia n.n

    1. Gracias. Bueno, para eso estamos, para mostrar cosas…

  3. Joooo, que entrada más buena Cesar, me encanta!!!! ojala tuviera los reactivos para hacerme con un saquito de luminol, la de horas que me iba a pasar jugueteando jajajajja.

    Buenísima la entrada n_n

    1. Muchas gracias! de todos modos, el luminol se puede comprar ya hecho y no es demasiado caro, pero yo solo lo he visto que lo vende Sigma Aldrich, que no vende a particulares, solo a laboratorios…

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